Analysis and engineering of central metabolism in Clostridium thermocellum

QC 2023-04-25

Abstract

För att mildra klimatförändringarna måste utsläppen av växthusgaser minskas till nettonoll år 2050 vilket kräver en drastisk förändring i dagens energisektor. För att uppnå detta mål förväntas användningen av biobränslen producerade från lignocellulosabaserade råmaterial, såsom jordbruks- och skogsrester, spela en viktig roll. Den naturliga förmågan att effektivt bryta ned lignocellulosa hittas hos den anaerobiska termofilen Clostridium thermocellum och gör denna mikroorganism till en lovande kandidat för konsoliderad bioprocessering av lignocellulosabaserade råmaterial till biobränslet etanol. För industriell implementering krävs dock förbättringar av etanolutbyte, -titer och -tolerans. Syftet med denna avhandling var att öka förståelsen av C. thermocellums centrala metabolism och därigenom vägleda framtida insatser inom metabol ingenjörskonst och processoptimering för att förbättra etanolproduktionen från lignocellulosabaserade råvaror.

Den atypiska glykolysen hos C. thermocellum använder pyrofosfat (PP_i) i stället för ATP som fosforyldonator. Denna skillnad har hypotiserats öka energieffektiviteten men samtidigt minska den termodynamiska drivkraften, och resultera i en lägre uppnåbar etanoltiter. Därför är en förbättrad förståelse av PP_i-metabolismen viktig ur fundamentala och applicerbara perspektiv. Knockoutstudier tillsammans med fysiologisk karaktärisering av fyra predikterade metaboliska PP_i-källor gav värdefulla insikter i PP_i-metabolismen och visade att energifördelarna med användningen av PP_i sannolikt är begränsade. Vidare visade biokemisk karaktärisering av ATP-Pfk från C. thermocellum och andra bakterier att PP_i kan vara en viktig allosterisk regulator för bakterier med en PP_i-beroende glykolys.

Den låga termodynamiska drivkraften hos etanolproduktionsvägen kombinerat med ett flexibelt redoxnätverk är nyckelfaktorer som påverkar etanoltitern, -utbytet och -toleransen hos C. thermocellum. Förutom övervägande termodynamiska begränsningar visade fysiologisk karaktärisering av vildtypen och en modifierad icke-etanolproducerande stam, vid olika extracellulära etanolkoncentrationer och temperaturer, att även biokemiska begränsningar påverkar etanoltoleransen. Att sänka odlingstemperaturen reducerade de kaotropiska effekterna av etanol och förbättrade etanoltoleransen.

Produktion av biprodukter och ofullständigt substratutnyttjande minskar erhållna etanolutbyten. För att minimera produktionen av en specifik klass av biprodukter undersöktes mekanismen bakom aminosyrasekretion hos C. thermocellum. Cellobios- eller ammoniumbegränsade kemostater av vildtypen och knockout-stammar av NADPH-producerande och -konsumerande reaktionsvägar identifierade ett katabolisk överskott av NADPH som den främsta drivkraften bakom aminosyrasekretion. Malatshunten samt det ammoniumreglerade skiftet mellan olika assimileringvägar av kväve med specificitet för olika kofaktorer visade sig spela en nyckelroll i NADPH-metabolismen och aminosyrasekretionen. 

För att öka substratutnyttjandet användes laboratorieevolution kombinerat med reverse metabolic engineering som verktyg för att ge insikter i hur utnyttjande av glukos och fruktos kan förbättras. Laboratorieevolutionen resulterade i stammar med reproducerbar och konstitutiv tillväxt på dessa hexoser. Sedan identifierades två mutationer involverade i (reglering av) transport eller metabolism av dessa hexoser.

Tillsammans ger dessa forskningsrön värdefulla insikter i C. thermocellums centrala metabolism och underlättar framtida optimeringar av denna organism för konsoliderad bioprocessering av lignocellulosabaserat råmaterial till bränslen och kemikalier.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-326160