Gating and modulation mechanism of voltage gated sodium channels

QC 2023-05-08

Abstract

Spänningsstyrda natriumkanaler (Nav-kanaler) är viktiga för att leda nervimpulser i exciterbara celler. Således är denna kanal involverad i flera neurologiska och muskulära störningar. Att förstå deras mekanism är avgörande för att utforma läkemedel som har denna kanal som mål. Nav-kanaler är tetramera membranproteiner som selektivt transporterar natriumjoner över membranet. De reglerar jonflödet genom att växla mellan tre huvudsakliga funktionstillstånd - vilotillstånd, öppet tillstånd och inaktiverat tillstånd. Strukturbiologiska tekniker har funnit strukturer av Nav-kanaler i flera funktionella tillstånd, varav de flesta strukturerna fångas i ett inaktiverat tillstånd. Trots att det är utmanande att experimentellt komma fram till det öppna tillståndet på grund av dess kortlivade natur har flera strukturer av bakteriella och eukaryota Nav-kanaler fångats i det förmodade öppna tillståndet. Idag finns dessvärre ingen rigorös funktionell annotering av dessa strukturer i det öppna tillståndet.Molekylärdynamiska simuleringar visade att i de experimentellt lösta bakteriella Nav-kanaler som fångats i det förmodade öppna tillståndet, var poren dehydrerad och hade en hög fri energibarriär för passiv jon-/läkemedels transport, vilket tyder på att dessa strukturer inte motsvarar ett funktionellt öppet tillstånd. Helixarna som omringar poren i dessa protein är vanligtvis 𝛼-helix-karaktär, men sekvens-/strukturkonserveringsanalys i andra medlemmar av jonkanalsfamiljen visade att ibland kan 𝜋-helixar förekomma runt poren. Genom att introducera 𝜋-helixar i mitten av dessa pornära helixar hydratiserades poren och förminskade drastiskt den fria energi barriären för jon-/läkemedels genomträngning. 𝜋-helixarna kan också vara relevanta för poröppning eftersom de dehydrerar de perifera kaviteterna och minskar interaktionerna mellan de hydrofoba pornära regionerna och därmed tillåter öppning av den hydrofoba poren. Dessutom identifierades också en oordnad region i den C-terminala domänen som är känd för att vara relevant för poröppning.

Effekten av 𝜋-helixar på läkemedelstillgång och bindning till natriumkanaler studerades också. Resultatet var att 𝜋-helixar i den bakteriella Nav-kanalen blockerade laterala öppningar mot porregionen oberoende av pordiametern, vilket hämmade tillgången genom dessa laterala öppningar. Vidare undersöktes läkemedels bindning såväl som läkemedelsmolekylen Lidocains bindande till olika funktionella tillstånd, vilket visade att läkemedlet binder i olika orienteringar och positioner i olika funktionella tillstånd. Detta innebär att det kan finnas en förändring i den bindande affiniteten hos lidocain när kanalen växlar mellan olika funktionella tillstånd. Läkemedelsmolekylernas bindningsregion undersöktes också, vartill vägen för Cannabidiolbinding i natriumkanaler och effekten av Cannabidiol på membranets egenskaper kunde utforskas. Våra beräkningsresultat kompletterades med experimentella resultat. MD simuleringar tyder på att cannabis inte påverkade membranets styvhet och orsakade en ordning av membranets metylener, vilket är överensstämmer utmärkt med NMR-resultaten. Mutationsexperiment visar att cannabidiol blockerar porerna genom att interagera med en Fenylalanin-aminosyra som stämmer väl överens med våra docknings resultat. Adiabatically Biased Molekylärdynamiska simuleringar utfördes för att bekräfta vägen för CBD att nå porerna är genom dem laterala öppningarna i jonkanalen.

Idén om att 𝜋-helixar kan vara relevanta för poröppning generaliserades därefter till eukaryota Nav-kanaler. Eukaryota kanaler är heterotetrameriska, so poromringande helixar från olika homomerer kan påverka kanalens funktion på olika sätt. Genom MD simuleringar kunde det fastställas att antalet 𝜋-helixar i porregionen ökade inte bara hydreringen genom poren och jonkonduktants, men också förminskade barrirären för passiv jontransport. I synnerhet var 𝜋-helixar i homomer I och IV i det förstorade portillståndet viktiga för ett funktionellt öppet tillstånd.Genom att sammanställa ovanstående resultat demonstrerades de bakteriella experimentella strukturerna som ursprungligen föreslogs representera öppna tillstånd i stället kunde motsvara inaktiverade tillstånd. I eukaryoter motsvarar den experimentella strukturen som initialt föreslagits representera det öppna tillståndet ett öppet tillstånd under konduktans. Därför föreslås i detta arbete att en 𝜋 till 𝛼 helix övergång och vice versa kan vara relevant för reglering av poröppning i Nav-kanaler. Dessa resultat betonar vikten av att noggrant klassificera experimentella strukturer och tilldela deras funktionella tillstånd. Slutligen påvisades även kraften hos MD simuleringar, som kunde användas inte bara för att rigoröst klassificera experimentella strukturer utan också för att tillhandahålla atomistiska detaljer för att förklara experimentella resultat.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-326566