Lytic polysaccharide monooxygenases for green production of cellulose nanomaterials

QC 2022-05-23

Abstract

Cellulosa är den huvudsakliga strukturella polymeren i trä, och dess potential i form av nanomaterialbyggstenar, nanocellulosa, har nu erkänts. Nanocellulosa, inklusive cellulosa nanofibrer (CNF) och cellulosa nanokristaller (CNC), har blivit allt viktigare i utvecklingen av moderna hållbara material. Nanocellulosa tillverkas vanligtvis av trämassafibrer genom kemiska förbehandlingar som avsätter laddade funktionella grupper på cellulosamikrofibrillerytor, vilket främjar sönderdelning av fibercellväggen under mekanisk fibrillering. På grund av miljörisker relaterade till användningen av hårda kemiska behandlingar är det avgörande att utveckla grönare, naturinspirerade alternativ. Som välkända nedbrytare av trä utsöndrar svampar cellulosaaktiva enzymer som arbetar under vattenhaltiga reaktionsförhållanden. Av dessa enzymer har lytiska polysackaridmonooxygenaser (LPMO) väckt ett speciellt intresse för grön produktion av nanocellulosa på grund av deras förmåga att introducera laddade karboxylgrupper på cellulosaytor. Lite är dock känt om egenskaperna hos LPMO-oxiderade nanocellulosa, deras mekaniska prestanda i bulkmaterial och mekanismen för hur LPMO underlättar fibrillering av träfibercellerna.

Denna doktorsavhandling syftade till att dissekera potentialen hos C1-oxiderande LPMO vid produktion av nanocellulosa och att klargöra mekanismen för LPMO-oxidation som underlättar sönderfallet av träcellvägg. LPMO:er med och utan bifogade kolhydratbindande moduler (CBM) producerades rekombinant i Pichia pastoris och studerades för produktion av CNF:er och CNC:er, som vidarebearbetades till bulkmaterial. Nanocellulosornas morfologi och egenskaper samt de optiska och mekaniska egenskaperna hos bulkmaterialen karakteriserades. Dessutom användes delignifierat trä med en bevarad cellstruktur som modellsubstrat för LPMO-oxidation, och de LPMO-inducerade förändringarna i träets cellväggsstruktur undersöktes med hjälp av avancerad spridningsteknik.

Resultaten av CNF-produktion visade att LPMO-oxiderade trämassafibrer kan omvandlas till diskreta och kolloidala CNF:er genom mild mekanisk sönderdelning, analogt med kemiska förbehandlingar såsom 2,2,6,6-tetrametylpyperidin-1-oxiradikal (TEMPO)-medierad oxidation. Viktigt är att dessa CNF var väl individualiserade med en genomsnittlig bredd på 4 nm, som liknar den för cellulosamikrofibriller i trä. Sådana CNF erhölls från barrvedsholocellulosa- och kraftmassafibrer med en hemicellulosahalt på 16–19 %, men inte från dissolvingmassa med en lägre hemicellulosahalt på 4 %. Nanopapper framställda från LPMO-oxiderade CNF var transparenta och de visade draghållfastheter på 260 MPa och Youngs moduler på 17 GPa. Vattensuspensionerna av LPMO-oxiderade CNF:er uppvisade också syrautlöst gelningsbeteende på grund av de enzymatiskt införda karboxylgrupperna.

LPMO-oxidation visade sig också vara användbar vid framställning av CNC från mikrokristallin cellulosa. De LPMO-oxiderade CNC:erna hade en nålliknande morfologi och de bildade stabila kolloidala suspensioner i vatten som visade flödesinducerad dubbelbrytning. Lösningsgjutna filmer visade att CNC:er som bär C1-karboxylgrupper hade den avgörande förmågan att genomgå självmontering till en anisotrop fas. Eftersom vissa LPMOs är bifogade till en icke-katalytisk CBM, bestämdes också effekten av denna modul på nanocellulosaproduktionen. CBM visade sig öka frisättningen av karboxylgrupper från cellulosamikrofibrillerytor i form av lösliga cello-oligosackarider. Däremot introducerade en icke-modulär LPMO fler karboxylgrupper på cellulosaytorna, upp till 0,53 mmol g^-1 på CNF och 0,70 mmol g^-1 på CNC. I själva verket befanns en icke-modulär LPMO vara fördelaktig vid produktion av både CNF och CNC.

Trots LPMOs viktiga roll för naturlig och bioteknisk nedbrytning av träbiomassa, har de LPMO-inducerade förändringarna i träcellväggstrukturen förblivit okända. I detta arbete präglades dessa förändringar för första gången. Det visades att en C1-oxiderande LPMO kan modulera cellulosamikrofibriller och störa träcellväggens ultrastruktur genom att modifiera cellulosaytans kemi. Efter LPMO-oxidationen ökade det genomsnittliga avståndet mellan cellulosamikrofibrillerscentra från 4,1 nm till 10,7 nm, vilket indikerar separationen av mikrofibriller i en mikrofibrillbunt. Detta resultat avslöjade en tidigare oidentifierad roll för C1-oxiderande LPMO vid nedbrytning av cellulosa i nanoskala. Anmärkningsvärt nog kunde LPMO-behandlade träfaner komprimeras ytterligare till anisotropa, transparenta filmer med en ultrahög draghållfasthet på 824 MPa.

Sammanfattningsvis klargjorde denna doktorsavhandling potentialen hos C1-oxiderande LPMOs i grön produktion av nanocellulosa och visade att LPMO-oxidation är en lämplig metod för att erhålla högpresterande isotropa och anisotropa bulkmaterial från trä. På basis av de erhållna resultaten föreslogs också en ny modell som belyser mekanismen för cellulosanedbrytning på nanoskala. Denna studie breddade förståelsen av LPMO inklusive deras biologiska och biotekniska betydelse och gav nya insikter om användningen av LPMO för framställning av cellulosabaserade nanomaterial.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-312822