Engineering conditional binding for enhanced protein therapeutics

QC 2024-11-21

Abstract

Proteinbaserade läkemedel har stor potential inom cancerbehandling eftersom de kombinerar specificitet med effektiv leverans till tumörområden. Traditionella antikroppar har dock begränsningar kopplade till storlek, produktionskostnad och stabilitet. Som ett alternativ erbjuder mindre proteinscaffolds en lovande metod, med lägre kostnader tack vare produktion i bakterieceller, högre stabilitet och mångsidig möjlighet till anpassning för olika funktioner. 

Denna avhandling syftar till att bidra till området för konstruerade proteinscaffolds genom att optimera upptäcktsprocessen, introducera ett nytt scaffold med villkorlig bindning och utvärdera dess användbarhet som protein-läkemedelskonjugat för riktad cancerbehandling. 

Den första delen av denna avhandling fokuserar på att effektivisera selektionsprocessen för proteinscaffolds. Studie I presenterar ett optimerat high-throughput-fagdisplaysystem som inkluderar automatiserade selektions- och sekvenseringstekniker för att effektivt identifiera proteinerabindare, som exemplifieras med bibliotek av albuminbindande domäner (ADAPT) och kalciumreglerade affinitetsproteiner (CaRA). Detta halvautomatiserade system minskar den manuella arbetsinsatsen och ökar robustheten, vilket gör selektiopnsprocessen mer tillgänglig för laboratorier utan högkostnadsutrustning. Resultaten visar möjligheten att generera högaffinitetsbindare med breda användningsområden inom diagnostik och terapi. Efter optimering av arbetsflödet introducerar Studie II CaRA-biblioteket mer ingående. Biblioteket är designat för att ge kalcium- och pH-beroende bindningsegenskaper, där kalciumnivåerna modulerar bindningen. Denna egenskap är särskilt fördelaktig för terapeutiska applikationer som kräver exakt målstyrning och kontrollerad dissociation. CaRA-scaffoldet uppvisade stabilitet, nanomolära affiniteter och kalciumberoende bindning till olika måll, med potential både inom terapi och bioteknologiska applikationer. Studie III introducerar en accelererad affinitetsmatureringsprocess för villkorliga bindare för att ytterligare förbättra de terapeutiska möjligheterna för små proteinscaffolds. Med hjälp av djupsekvenseringsdata från initiala selektioner med CaRA-biblioteket och E. coli display-screening utvecklades en högaffinitetsbindare för HER3 med pH-beroende bindning, CaRA_HER3. Denna egenskap möjliggör snabb frisättning i sura miljöer, som efterliknar endosomala förhållanden, vilket kan vara fördelaktigt för intracellulär läkemedelsleverans. 

Den sista studien, Studie IV, fokuserar på tillämpningen av CaRA-bindare i utvecklingen av protein-läkemedelskonjugat för riktad cancerbehandling. Specifikt utvecklades en CaRA-baserad EGFR-bindare (CaRA_EGFR) för att binda EGFR villkorligt beroende på kalciumnivåer. Denna kalciumreglerade bindning möjliggör att proteinet dissocierar i den låga kalciumhalten i endosomer, vilket potentiellt ökar cytotoxisk läkemedelsleverans direkt till tumörceller. Konfokalmikroskopi bekräftade att CaRA_EGFR-bindaren effektivt internaliseras  och transporteras till lysosomer, vilket uppnår riktad cytotoxicitet i EGFR-uttryckande celler. Detta tillvägagångssätt understryker värdet av villkorlig affinitet i utmaningar kopplade till receptorernas biologiska öde, och banar väg för effektivare, receptor-specifika läkemedelsleveranssystem. Denna avhandling främjar proteiningenjörskonst för små scaffold-baserade terapeutiska proteiner genom nya upptäcktsarbetsflöden och kalcium- och pH-beroende bindningsmekanismer. Genom att utveckla nya s.tt att konstruera dessa scaffolds bidrar resultaten till säkrare och effektivare proteinbaserade terapier för cancerbehandling.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-356757