Advancing 3D Cell Cultures of Stem-Cell Derived Pancreatic Islets and Breast Cancer Cells Using Recombinant Functionalized Spider Silk

QC 2024-08-30

Abstract

Odling av celler i 3D skapar en mer fysiologiskt relevant cellmiljö än konventionella 2D-kulturer. Interaktioner mellan celler och den extracellulära matrisen inducerar viktiga cellsignaler som reglerar celladhesion, migration, proliferation, differentiering och överlevnad. Denna avhandling syftar till att utveckla och analysera förbättrade 3D-cellodlingsmetoder för stamcellsderiverade pankreatiska öar (SC-islets) och bröstcancerceller, med hjälp av funktionaliserat rekombinant spindelsilke. Spindelsilke är ett naturligt proteinbaserat material med anmärkningsvärda mekaniska egenskaper som hög styrka och elasticitet. Det är också biologiskt nedbrytbart och cellkompatibelt. FN-silk, det rekombinanta spindelsilkesprotein som används i denna avhandling, är funktionaliserat med ett cellbindande motiv (RGD) från fibronektin, för att förbättra celladhesion. Anmärkningsvärt är att det går samman vid vätska-luft-gränsytan till en fibrillär struktur, vilket gör det gynnsamt som stöd för cellodling. I denna avhandling användes bioinformatiska metoder för att studera hur 3D-miljön påverkar cellernas genuttryck och den cellulära heterogeniteten i pankreatiska aggregat under en differentieringsprocess. Dessutom utfördes en bioinformatisk analys av effekten av 3D-cellodling av bröstcancercellinjer i FN-silknätverk. Den första delen av avhandlingen tar upp flera utmaningar vid transplantation av pankreatiska öar genom att presentera ett optimerat protokoll för pankreasdifferentiering från humana pluripotenta stamceller, förbättra in vitro-odling av dessa, samt utveckla en kryokonserveringsmetod för SC-islets. Differentieringsprotokollet som presenteras i Paper 1 resulterade i rena endokrina cellpopulationer och undviker oönskade prolifererande och icke-endokrina celler. Det visades också att dessa SC-islets mognade in vivo och kunde effektivt motverka diabetes i en diabetisk musmodell. Singel cell-RNA-sekvenseringsanalys gav nya insikter om den cellulära sammansättningen och genuttrycket hos SC-islets före och efter transplantation. I Paper 2 etablerades en innovativ metod för 3D-odling av SC-islets med hjälp av FN-silkesnätverk som imiterar den extracellulära matrisen. FN-silkesnätverken gav strukturellt stöd för in vitro-odling och hantering under in vivo-transplantation. Viabilitet och funktionalitet hos fria och FN-silkes inkorporerade SC-islets utvärderades och jämfördes. Singel cell-RNA-sekvenseringsanalyser bekräftade bibehållandet av cellernas sammansättning, med en något förbättrad mognad av beta-celler i SC-islets som stöddes av FN-silke. I Paper 3 utforskades en ny strategi för kryokonservering av SC-islets. Twisted vitrification-metoden, som tidigare använts för 2D-kulturer, anpassades för 3D-kulturer genom att använda integrering i FN-silkesnätverk för att underlätta hanteringen under vitrifieringsprocessen. Den andra delen av avhandlingen syftade till att utveckla en metod för 3D-odling av bröstcancerceller för att bättre efterlikna komplexiteten i tumörmikromiljön. I Paper 4 användes FN-silkesnätverk för att skapa en 3D-miljö för bröstcancerceller där viktiga cell-ECM-interaktioner kan etableras. Proliferationshastigheter och uttryck av nyckelmarkörer hos cellerna odlade i 2D jämfört med i FN-silkesnätverk undersöktes. Bioinformatisk analys av bulk-RNA-sekvenseringsdata användes för att jämföra bröstcancerceller i konventionella 2D-cellkulturer med de odlade i 3D med stöd av FN-silk. Sammanfattningsvis presenterar arbetet som utförts i denna avhandling betydande framsteg inom utveckling och analys av 3D-cellkulturer av både SC-islets och bröstcancerceller, vilket potentiellt kan förbättra terapeutiska tillämpningar, sjukdomsmodellering och läkemedelstester.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-352221