Super-resolution microscopy – photophysical implications and applications

QC-2024-05-20

Abstract

Oöverträffad specificitet och hög känslighet har gjort fluorescensmikroskopi till ett oumbärligt verktyg inom livsvetenskaperna. Dessa egenskaper härrör från användandet av ljusemitterande fluoroforer, inmärkta till de molekyler och strukturer man vill studera. Den diffraktionsbegränsade, maximalt uppnåeliga upplösningen hos traditionella mikroskop motsvarar grovt sett hälften av våglängden hos det ljus som används för observation. Under de senaste decennierna har emellertid superupplösningsmikroskopi (SRM) utvecklats, vilket möjliggjort att spatiell information kan erhållas långt bortom denna diffraktionsbegränsning. Även om olika SRM-tekniker använder olika principer för att uppnå superupplösning, förlitar sig de flesta av dem på att selektivt kunna slå på och av fluoroforemissionen inom en diffraktionsbegränsad volym. Vid excitation kan fluoroforer övergå till mörka, transienta tillstånd eller permanent fotoblekas. Även om reversibla övergångar kan användas för att uppnå superupplösning minskar de också den totala emissionen. Karakterisering och modellering av fotofysikaliska övergångar till mörka tillstånd är således mycket viktigt, eftersom de både kan ge en grund för och negativt påverka prestanda hos SRM. SRM har dock redan visat sig vara värdefullt inom biologisk och biomedicinsk forskning, där den förbättrade upplösningen ger en bättre förståelse av grundläggande molekylära mekanismer i celler samt öppnar för framtida diagnostiska möjligheter.

Denna avhandling presenterar två tillämpningar av SRM. I arbete I använde vi STED (stimulated emission depletion) SRM för att avbilda påverkan på beta-aktinfilament i neuroner infekterade med Streptococcus pneumoniae, vilket ledde oss till att föreslå en möjlig mekanism för neuronal död vid bakteriell meningit. I arbete II avbildades de nanoskaliga distributionsmönstren hos sex olika trombocyterproteiner med STED för att hitta aktiveringsspecifika distributionsförändringar hos proteinerna vid samtidig inkubering av trombocyterna med cancerceller. Effektiva metoder för bildgenerering, analys och klassificering utvecklades likaledes, vilket kan öppna förutsättningar för SRM-baserad minimalt invasiv cancerdiagnostik.

Fotofysikaliska övergångar hos fluoroforer och deras inverkan på SRM studerades också. Kumulativ fotoblekning vid volymetrisk STED-avbildning och hur det kan påverka tagna STED-bilder studerades experimentellt och verifierades genom simuleringar i arbete III. Effekten av fluoroforers övergångar till transienta mörka tillstånd i superupplöst MINFLUX (minimal photon fluxes) studerades i arbete IV. I detta arbete mättes fotofysikaliska reaktionshastigheter hos cyaninfärgämnen i det nära-infraröda (NIR) våglängdsområdet med hjälp av TRAST (transient state) spektroskopi. Hur dessa fotofysikaliska övergångar utvecklades över tid under MINFLUX-lokaliseringar simulerades sedan, vilket visade att de kan ge upphov till lokaliseringsfel. Genom den förvärvade kunskapen om de transienta tillstånden och hur de påverkar lokaliseringen i MINFLUX-experiment var det dock därefter möjligt att anpassa prov- och excitationsförhållandena, och demonstrera MINFLUX-avbildning i NIR området. Detta visar således att svagt emitterande och blinkande NIR-fluoroforer trots allt kan användas i MINFLUX.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-346581