Proteomic strategies for blood biomarker development in rare dystrophinopathies

QC 2023-10-23

Abstract

Duchenne muskeldystrofi (DMD) och Becker muskeldystrofi (BMD) är två ovanliga, genetiska sjukdomar som går under samlingsnamnet dystrofinopatier. Dystrofinopatier orsakas av att proteinet dystrofin antingen saknas helt eller uttrycks vid längre koncentration i muskler och hjärta än normalt. På grund utav onormalt dystrofinsyntes så förlorar patienter muskelmassa över tid samt upplever påverkan på hjärta och lungor. Ibland har patienter även nedsatt kognitiv förmåga. DMD är den allvarligare formen av dystrofinopati. De första symptomen märks redan i små barn och leder till förlorad förmåga att gå i yngre tonåren samt förkortad livslängd. I DMD uttrycks dystrofin i mindre än 3% än uttrycket i friska muskler, oftast som följd av mutationer som orsakar tidigt avslut av proteinsyntes (s.k. ramförskjutningsmutationer). BMD-patienter, å andra sidan, har ett något högre men variabelt uttryck av dystrofin jämfört med DMD och ofta i kombination med stora interna deletioner. Detta reducerade uttryck av dystrofin resulterar i en mildare fenotyp än DMD. Under det senaste decenniet har forskare fokuserat på att utveckla behandlingsmetoder som kan öka uttrycket av dystrofin i DMD-patienter och därmed förlänga patienternas livslängd samt även förlänga tiden då patienten kan gå självständigt. Den första genterapin för DMD godkändes av USA:s läkemedelsmyndighet Food and Drug Administration (FDA) i juni 2023, men saknar än så länge myndighetsgodkännande i Europa. Myndighetsgodkännanden för behandlingar av DMD har i flera fall baserats på att ett ökat inducerat dystrofinuttryck observerats i muskelbiopsier efter behandling, vilket enligt FDA sannolikt tyder på en klinisk fördel från behandlingen. Dessa tester kräver dock att patienten donerar upprepade muskelbiopsier. Dystrofinuttryck i muskel används här som en s.k. biomarkör. 

Biomarkörer är biokemiska eller fysiologiska laborativa tester som mäter en biologisk process eller tillstånd. Det finns idag ett behov av nya biomarkörer för att följa sjukdomsförlopp i dystrofinopatier samt biomarkörer som kan användas till att förutsäga utfall i kliniska studier. Eftersom denna patientgrupp ofta består av unga individer så är det viktigt att utveckla nya biomarkörer från mindre invasiva prov-material än muskelbiopsier, så som blod eller urin.

I denna avhandling så har vi använt oss utav affinitetsproteomik samt masspektrometri för att identifiera och validera blodbiomarkörer för DMD och BMD. Det övergripande målet har varit att identifiera biomarkörer med förmågan att särskilja patienter med olika nivåer av både dystrofinuttruck samt progression, för att senare kunna identifiera biomarkörer för att övervaka effekt av genterapier i DMD. I Artikel I använde vi oss utav en så kallad ”suspension bead array” (SBA)-teknologi för att identifiera biomarkörskandidater för sjukdomsprogression i DMD. Vi identifierade tio proteiner relaterade till progression. Analytisk validering av dessa tio biomarkörskandidater genomfördes i Artikel II med hjälp av två ortogonala, absolutkvantitativa metoder, ”Parallell Reaction Monitoring” masspektrometri (PRM-MS) samt ”sandwich immunoassay”. Detta resulterade i analytisk validering av fem biomarkörer för att följa sjukdomsutveckling i DMD (CA3, MYL3, LDHB, COL1A1 samt FGG).

Även om både DMD och BMD orsakas av mutationer i samma gen, så finns det skillnader i både sjukdomsprogression och symptom mellan de två patientgrupperna. I Artikel III använde vi masspektrometri för att studera skillnader och likheter i blodproteomet mellan DMD och BMD över tid, vilket visade på diskrepanser i vilka biomarkörskandidater som är lämpliga för att följa sjukdomsprogression i dessa två sjukdomar.

I Artikel IV letade vi efter blodbiomarkörer med förmågan att reflektera förändrat dystrofinuttryck i kliniska studier för genterapier. Vi identifierade tio proteiner som korrelerade med dystrofin- samt mikrodystrofinuttryck i plasma från en DMD-musmodell behandlad med en mikrodystrofinterapi. Av dessa tio proteiner konstaterade vi att myosin lätt kedja 3 (MYL3) minskar snabbare över tid i serum från dystrofinopati-patienter med lågts eller inget dystrofinuttryck än i patienter med högre uttryck. Två ytterligare proteiner, titin (TTN) och serum-läckage av dystrofin, var associerade med dystrofinuttryck i muskler.  

Endast en tidigare publikation påvisar att dystrofin kan vara en blodbiomarkör för DMD. Då många terapier för DMD i kliniska studier har som syfte att öka dystrofinuttrycket så skulle möjligheten att detektera läckage av dystrofin i blod kunna bidra med värdefull information om terapeutisk effekt. I Artikel V designade vi därför en ”proof of principle”-studie för att utforska om dystrofin kan detekteras i blod och i så fall om det kan utgöra en rimlig biomarkörskandidat.

Sammanfattningsvis utforskar denna avhandling biomarkörer för att följa sjukdomsförlopp och utvärdera genterapier i DMD och BMD. Från våra resultat föreslår vi tre biomarkörskandidater: MYL3, TTN samt dystrofin i serum.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-338366