Till innehåll på sidan

On the application and validation of multiplexed affinity assays

Tid: Fr 2020-10-02 kl 13.00

Plats: https://kth-se.zoom.us/j/64701056914, (English)

Ämnesområde: Bioteknologi

Respondent: Tea Dodig-Crnković , Affinity Proteomics, Science for Life Laboratory, SciLifeLab

Opponent: Dr Norman Leigh Anderson, SISCAPA Assay Technologies, Washington DC, USA

Handledare: Universitetslektor Jochen M. Schwenk, Science for Life Laboratory, SciLifeLab, Affinity Proteomics; Mun-Gwan Hong, Science for Life Laboratory, SciLifeLab; Professor Peter Nilsson, Science for Life Laboratory, SciLifeLab, Affinity Proteomics

Exportera till kalender

Abstract

Proteiner är makromolekyler som utför essentiella funktioner i människans celler, vävnader, och organ. De deltar i många olika biologiska processer och kan exempelvis skydda mot patogen, så som bakterier och virus. Proteiner är en av kroppens viktigaste byggstenar och förändringar i deras aktivitet kan leda till sjukdom. Genom att studera proteiner i friska och sjuka individer kan vi få en bättre inblick om de bakomliggande molekylära processer som orsakar sjukdom, samt identifiera målprotein för läkemedelsutveckling. Proteinanalys har varit och kommer att fortsätta vara ett viktigt verktyg inom sjukvården.

Arbetet i denna avhandling berör affinitetsbaserade metoder för proteinanalys. Antikroppsarrayer med hög kapacitet att mäta många proteiner parallellt har tillämpats för att studera proteiner i blod. Dessutom har metoden använts för att identifiera och validera proteininteraktioner som kan vara relevanta för läkemedelsstrategier. Forskningsprojekten som presenteras här har ämnat att validera de undersökningarna som utförts genom att bland annat replikera resultaten i olika patientprov. Antikropparnas selektivitet har bekräftats genom jämförelser av olika proteinanalyser, antikroppsfria metoder, samt genetisk variation.

I Paper I tillämpades en antikroppsarray bestående av 1.500 antikroppar för att studera proteiner som cirkulerar i blodplasma. Huvudsyftet var att undersöka hur proteinnivåer varierar över tid. Vi analyserade prov från 101 kliniskt friska individer som donerat blod var tredje månad under ett års tid. Proteindata visade att det fanns en inter-individuell mångfald och att varje individ har ett unikt proteinbaserat ”fingeravtryck”. Vidare fann vi att 49% av de studerade proteiner hade låg variabilitet inom varje individ och var stabila under året. Vi identifierade åtta grupper bestående av 11-242 proteiner som samordnat varierade under ett år. Femton proteiner var associerade till genetisk variation och ett urval av dessa bekräftades i en separat studie som inkluderade 3.000 personer. Sammanfattningsvis fann vi att varje individ har en personlig och unik proteinprofil som är mestadels stabil under ett år, samt att det förkommer både kortsiktiga och långsiktiga förändringar i proteinuttrycket hos varje individ.

I Paper II analyserades proteiner som cirkulerar i blod och hur de är associerade till åldrande. Med hjälp av antikroppsarrayer undersöktes 156 individer i åldrarna 50-92 år och en association till åldrande identifierades för histidine-rich glycoprotein (HRG). Detta samband bekräftades även i en utökad analys av >4.000 blodprov från åtta separata kohorter. Vidare utvecklades en separat sandwich assay analysmetod för att utvärdera HRG-antikroppens affinitet. HRG-nivåer i blod som uppmättes med två olika antikroppar påvisade även stark association till en genetisk variant av HRG.

I Paper III studerades förekomsten av autoantikroppar mot cancer testis antigens (CTAs) i 133 patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Vi identifierade reaktivitet mot 29 unika CTAs i patienter med NSCLC som ej påvisade reaktivitet i 57 prov från individer med godartade lungsjukdomar. Reaktiviteten för sex av dessa CTAs kunde bekräftas i ytterligare 34 NSCLC-patienter. Analys av longitudinella prover från sju patienter påvisade att uttrycket av CTA-autoantikroppar var stabilt under studieperioden för samtliga patienter.

I Paper IV utvecklades en ny antikroppsbaserad analysmetod för detektion av proteiner som bildar komplex med G-proteinkopplade receptorer (GPCRs). Denna familj av membranprotein är viktig för många läkemedel. Det finns underlag för att GPCRs funktioner kan regleras via receptor activity-modulating proteins (RAMPs), en annan grupp av proteiner som kan bilda komplex med GPCRs. Med den nya analysmetoden studerade vi 23 stycken GPCRs i kombination med tre stycken RAMPs i cellysat. Vi kunde bekräfta majoriteten av tidigare rapporterade komplex, och kunde vidare identifiera ytterligare 15 helt nya GPCR-RAMP-komplex. Ett urval av interaktionerna validerades med hjälp av epitoptaggar på proteinerna, samt med hjälp av in situ proximity ligation assays.

Sammanfattningsvis beskriver arbetet i denna avhandling användning av en affinitetsbaserad metod för proteinforskning i blodplasma, samt undersökning av proteininteraktioner. Studierna belyser metodens potential för identifikation av cirkulerande proteiner som kan komma att addera kunskap till det vi idag känner till om hälsa och sjukdom.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-279420