Development of directed-evolution methods utilizing combinatorial protein libraries in Escherichia coli
Tid: Ti 2024-06-04 kl 13.00
Plats: F3 (Flodis), Lindstedtsvägen 26 & 28, Stockholm
Språk: Engelska
Ämnesområde: Bioteknologi
Respondent: Luke Parks , Proteinvetenskap
Opponent: Professor Ola Söderberg, Department of Pharmaceutical Biosciences, Uppsala University, Sweden
Handledare: Professor John Löfblom, Skolan för teknikvetenskap (SCI), Proteinvetenskap, Proteinteknologi; Professor Stefan Ståhl, Albanova VinnExcellence Center for Protein Technology, ProNova, Proteinteknologi
QC 2024-05-06
Abstract
Riktad evolution med hjälp av kombinatoriska proteinbibliotek är en oerhört kraftfull teknik för att ta fram proteiner med nya eller förbättrade egenskaper. En viktig del i sådana tekniker är att det finns en länk mellan individuella proteinvarianter och deras motsvarande genetiska information. För att tillhandahålla denna länk nyttjar de mest framgångsrika metoderna mikroorganismer, såsom bakteriofager, bakterier eller jästceller för produktionen och uttryck av proteinbibliotek. Denna avhandling fokuserar på utveckling och tillämpning av nya riktade evolutionsmetoder som använder bakterien Escherichia coli (E. coli) för selektion av nya affinitetsproteiner och proteaser.
Den första studien syftade till att förändra substratspecificiteten för ett proteas från tobacco etch virus (TEV). För detta ändamål utvecklades en metod baserad på expression av intracellulära proteasbibliotek, och använde ett reporterfusionsprotein bestående av amyloid β-peptid fuserad till N-terminalen av förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP). Varianter screenades för proteolytisk aktivitet på samuttryckt målsubstrat med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Efter tre rundor av FACS selekterades ett antal varianter av TEV-proteas som uppvisade förbättrad proteolytisk aktivitet på det nya substratet.
Studierna två till fyra beskriver utvecklingen av en annan E. coli-metod som utforskades för riktad evolution av affinitetsproteiner. Metoden är baserad på expression av rekombinanta proteiner på det yttre membranet av E. coli via fusion till en bakteriell autotransporter, adhesin involved in diffuse adherence I (AIDA-I). Den andra studien fokuserade på optimering av metoden och dess tillämpning inom riktad evolution. I studien utvärderades flera olika affinitetsproteiner för expression via AIDA-I i en panel av E. coli-stammar. Resultaten visade att relativt små affibodymolekyler uttrycktes i höga nivåer, medan större och mer komplexa proteiner, såsom antikroppsfragment, varierade i uttryck och bara fungerade i vissa modifierade stammar. I studien utvecklades även ett protokoll för magnet-assisterad cellsortering (MACS) med syftet att möjliggöra selektion av bindare från mycket stora bibliotek.
I den tredje och fjärde studien utvärderades den nya E. coli-metoden i kombination med MACS-protokollet för selektion av nya affibodymolekyler.
I den tredje studien konstruerades ett stort naivt affibody-bibliotek (>1,5×1011 varianter). Potentialen hos metoden och det nya biblioteket utvärderades genom selektion av bindare mot två cancer-associerade receptorer, tumor-associated calcium signal transducer 2 (TROP-2) och lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3). MACS och FACS användes i selektionsprocessen, och kombinerades med flödescytometrisk analys av biblioteket mellan rundorna, för att övervaka selektionen. Båda selektionerna resulterade i nya bindare med relativt hög affinitet till sina respektive receptorer.
I den fjärde studien konstruerades ett riktat bibliotek med syftet att förbättra egenskaperna hos en affibodymolekyl mot carbonic anhydrase IX (CAIX). Selektionen inkluderade stringenta förfaranden för att anrika varianter med långsam dissociation. Analys efter FACS visade på varianter med förbättrad affinitet och stabilitet jämfört med tidigare rapporterade bindare.
Sammanfattningsvis visar arbetet i denna avhandling potentialen hos E. coli-baserade metoder för selektion av nya proteiner med förändrade eller förbättrade egenskaper.