Concepts and biomedical applications of excitation-modulated transient state monitoring of fluorescence emitters

QC 2023-05-22

Abstract

Fluorescensmetoder har utvecklats mycket starkt under det senaste decenniet, vilket har möjliggjort detektion av enstaka molekyler, med hög specificitet, hög upplösning i tid och rum, samt snabba avläsningshastigheter. Sammantaget gör detta fluorescens till en mycket central avläsningsmodalitet för biomolekylära och cellulära studier. Fotofysiken för de fluorescensmarkörer, fluoroforer, som används är av central betydelse hur fluorescensmetoder presterar. Här sätter fluoroforernas fotostabilitet och ljusstyrka, men också deras blinknings- egenskaper tydliga gränser för prestandan. Fluoroforblinkande, som härrör från fotoinducerade, icke-fluorescerande övergående tillstånd av fluoroforer, kan emellertid också utnyttjas inom cellulära och biomolekylära studier. Blinkande är en förutsättning för i stort sett alla så kallade fluorescensbaserade superupplösningstekniker. Dessutom är fluorophorers blinkningsbeteenden ofta känsliga för mikromiljöparametrar som pH, syrekoncentrationer, redoxförhållanden och viskositet. Detta följer av det faktum att de underliggande, icke-luminescerande, mörka transienta tillstånden vanligen har 10³ till 10⁶ gånger längre livslängder än de fluorescerande exciterade tillstånden hos fluoroforerna. Detta ger fluorescerande molekyler i mörka tillstånd mer tid att interagera med sin omgivning i biologiska miljöer. Blinkningskineitk hos fluoroforer kan således användas som en alternativ avläsningsparameter för att ge användbar information om molekyler, celler och deras miljöer, utöver vad som kan erhållas med traditionella fluorescensmetoder. Denna avhandling utgår från en spektroskopiteknik, s.k. transient state (TRAST) spectroscopy, utformad för att övervaka sådana långlivade, mörka transienta tillstånd, inklusive triplett, fotooxidation, fotoreduktion och fotoisomeriserade tillstånd av fluoroforer. Principen med TRAST bygger på att mäta hur den tidsgenomsnittliga fluorescenssignalen som detekteras i ett prov ändras vid systematisk variation av excitationsmoduleringen.

Huvudfokus för denna avhandling är att utvidga möjligheterna med TRAST att monitorera långlivade mörka transienta tillstånd hos fluoroforer i lösning, lipidmembran och levande celler. För detta anpassade och utvecklade vi olika TRAST-modaliteter och visade sedan deras användbarhet i olika applikationer. Först visade vi hur de relativt låga krav på ljusemission från fluoroforer studerade med TRAST gjorde det möjligt att karakterisera de fotofysikaliska egenskaperna hos karboxy-fluorescein, en fluorofor med hög tripletformering (artikel I). Vi visade även metodens förmåga att känna av hur brom- och jodidatomer påverkade bildningen av långlivade triplett-tillstånd och fotooxidation hos karboxyfluorescein, samt de inblandade övergångshastigheterna. Därefter utvecklade och demonstrerade vi ett koncept baserat på TRAST-metoden och visade dess förmåga att särskilja fluoroforer med olika blinkningsegenskaper, som ett sätt att utföra fluorescensbaserad streckkodning och multiplexering. Detta koncept, demonstrerat genom att utnyttja de av TRAST väl urskiljbara fotofysiska övergångarna hos två olika fluoroforer som emitterar i samma spektralområde, demonstrerades i artikel II. I samma arbete utvecklade vi också en TRAST-modalitet för mikrofluidik-mätningar av molekyler och lipidvesiklar, i vilka streckkodningskonceptet kunde demonstreras när molekylerna och vesiklarna passerade genom mikrofluidkanalen. Dessutom, med TRAST implementerad i kamerabaserad widefield mikroskopi, visade vi att flerfärgade bilder av celler kan erhållas med hög rumslig upplösning, där för första gången blinkningsegenskaperna hos de olika fluorforerna kunde användas för att särskilja dem i cellerna. De två sista artiklarna i denna avhandling beskriver ytterligare utvidgningar av TRAST-konceptet, byggande på monitorering av fluorescensblinkningar i levande celler. I artikel III användes TRAST tillsammans med widefield mikroskopi samt FCS för att studera veckningen av färgämnesmärkta RNA-strängar till s.k. G-quadruplex-strukturer, i lösning samt i levande celler. Här utnyttjade vi fotoisomeriseringskinetiken och resulterande fluorescensblinkningar hos ett cyaninfärgämne som avläsningsparameter, och den höga känsligheten hos denna fotoisomerisering för viskositet och steriska begränsningar, för att övervaka konformationsförändringar av RNA i cellerna. Slutligen, i artikel IV, visade vi hur TRAST-avbildning gör det möjligt att utnyttja fotoinducerade mörka tillstånd hos en mitokondriell lokaliseringsfluorofor (n-Nonyl Acridine Orange, NAO), för att ge denna lokaliseringsprob även omgivnings-avkännande egenskaper.

Sammanfattningsvis visar de experimentella resultaten och artiklarna som ingår i denna avhandling att fluorescensblinkningar representerar en rik källa till information för biomolekylära och cellulära studier. Genom TRAST-tekniken, och de varianter som ytterligare anpassats och utvecklats i detta arbete, visar vi att det är möjligt att utnyttja denna rika källa av kompletterande information i ett brett urval av prover. Arbetet i denna avhandling tyder på att ytterligare kombinationer av klassiska fluorescensavläsningar och en fortsatt utveckling av olika TRAST-modaliteter kommer att kunna öppna nya möjligheter för molekylära interaktionsstudier inom biologisk forskning.

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-327071