Engineering of alternative scaffold derived drug conjugates and fusion-toxins for targeted cancer therapy

Abstract

Cancer är ett stort hälsoproblem, med för tidig död för många patienter och med en hög ekonomisk kostnad för samhället. Sjukdomen är komplex att behandla på grund av de många olika sorter som finns, men också för att de sjukdomsframkallande cellerna, som måste avlägsnas, är mycket lika de normala cellerna. Traditionell kemoterapi och strålbehandling har därför ett smalt terapeutiskt fönster. Riktad cancerterapi syftar till att på ett precist sätt leverera ett läkemedel till tumörvävnaden genom att känna igen biomarkörer som endast, eller åtminstone mestadels, är associerade med cancercellerna. Läkemedelskonjugat och fusionstoxiner är två typer av riktade läkemedel. De består båda av ett protein som målsöker tumören, en länk och en cytotoxisk last. Effektiviteten av läkemedelskonjugat och fusionstoxiner bestäms av deras tumörmålsökande förmåga och deras cytotoxicitet. Optimering av läkemedelskonjugat och fusionstoxiner handlar om att välja den bästa kombinationen av de tre komponenterna för att uppnå bästa effekt. 

I mina studier har jag arbetat med inriktning på human epidermal growth factor receptor 2 och 3, HER2 respektive HER3. Jag har använt affibodymolekyler: ZHER2 och ZHER3, och en ADAPT riktat mot HER2, ADAPT6. För förlängning av halveringstiden in vivo har jag använt en albuminbindande domän, ABD. Som cytotoxisk last har jag använt cellgifterna DM1, MMAE och MMAF, samt en trunkerad version av Pseudomonas exotoxin A, PE25. 

I artikel I var målet att undersöka arkitekturen för den tumörmålsökande delen av affibodybaserade läkemedelskonjugat. Sju olika varianter med olika antal och position av affibodys och ABD domäner designades och utvärderades, in vitro och in vivo. De skilde sig i sin effekt på cellproliferationen, där särskilt varianterna med två affibodydomäner ökade proliferationshastigheten för SKOV-3-cellinjen, som har högt uttryck av HER2. In vivo hade varianterna med en affibodydomän en längre retention i blod och lägre leverupptag jämfört med varianterna med två affibodydomäner. Två varianter valdes ut för karakterisering som läkemedelskonjugat, en som främjade cellproliferation starkt och en som endast hade en mindre effekt på cellproliferation. Konjugaten undersöktes som läkemedel för behandling av möss som bar HER2-överuttryckande SKOV-3-tumörer. Resultaten visade att affibody-läkemedelskonjugatet ZHER2-ABD-mcDM1 var det mest effektiva. ZHER2-ABD-mcDM1 undertryckte tumörtillväxt och förlängde medianöverlevnadstiden för mössen från 37 till 63 dagar. 

I artikel II var målet att undersöka egenskaperna hos affibody eller ADAPT- baserade fusionstoxiner, riktade mot HER2-receptorn. Resultaten visade att användningen av ZHER2 som målsökande domän, för att bära den toxiska peptiden PE25 till HER2-överuttryckande celler, var bättre än att använda en dubbel-HER2-bindare, bestående av ZHER2 och ADAPT6. Dessutom visade resultaten att PE25-baserade fusionstoxiner med hög affinitet till HER2 inte nödvändigtvis ökar den cytotoxiska effekten när en viss affinitet för receptorn har uppnåtts. 

I artikel III producerades och studerades det första HER3-riktade affibody- läkemedelskonjugatet. Den designades med det optimala formatet från artikel I, dvs affibody-ABD-mcDM1. Resultaten visade att läkemedelskonjugatet hade en potent cytotoxisk effekt på pankreas-cancer- cellinjen, BxPC3, med ett IC50-värde på 6 nM. Hos möss visade injektion av en radiomärkt version av ZHER3-ABD-mcDM1 upptag i implanterade BxPC3-tumörer med en topp på 6,3 ± 0,4 % ID/g, 6 timmar efter injektion. Den allmänna biodistributionen visade upptag i lever, lungor, spottkörtel, mage och tunntarm, organ som är kända för att naturligt uttrycka HER3. Sammantaget visar resultaten att ZHER3-ABD-mcDM1 är ett mycket potent och specifikt läkemedelskonjugat, som motiverar vidareutveckling, och möjligen undersökning av dess funktionalitet i experimentell terapi av HER3-överuttryckande tumörer hos möss och senare människor. 

I artikel IV var målet att undersöka olika cellgifter som en del av ett affibody- baserat läkemedelskonjugat riktat mot HER2. Den optimala arkitekturen från artikel I användes också här: ZHER2-ABD-last. De cytotoxiska laster som undersöktes var tubulin-polymerisations-hämmarna DM1, MMAE och MMAF. ZHER2-ABD-mcMMAF hade den mest potenta cytotoxiska effekten, med ett IC50-värde på 0,18 nM för SKBR3-celler med högt HER2-uttryck. ZHER2-ABD-mcMMAE fungerade inte så bra i cytotoxicitets-experimentet. En bättre länk som kopplar lasten till proteinet krävs förmodligen. ZHER2- ABD-mcMMAF var det bästa läkemedelskonjugatet med högst potens och lägsta upptaget i levern. Den var något bättre än ZHER2-ABD-mcDM1. 

Sammanfattningsvis täcker de fyra artiklarna generering och optimering av läkemedelskonjugat och fusionstoxiner baserade på affibodymolekyler och en ADAPT. I artiklarna identifierades och karakteriserades nya varianter med önskvärda egenskaper. 

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-308526