Combinatorial protein engineering for gene therapy and affinity protein applications

QC 2026-10-15

Abstract

Affinitetsproteiner är viktiga verktyg för att studera biologiska funktioner och används flitigt inom både läkemedelsområdet och bioproduktion. Många applikationer kräver proteiner med olika funktionella egenskaper, till exempel att de binder till specifika epitop eller proteinkonformationer, att de kan modulera proteiners aktivitet eller att de selektivt kan binda vissa celler eller organ. Arbetet i den här avhandlingen fokuserar på utvecklingen av nya affinitetsproteiner som har olika funktionella egenskaper, med målet att utveckla mer selektiva genterapier och förbättra relaterade produktions-processer.

Att använda djupsekvensering i samband med fagdisplay-selektioner, som beskivs i Studie I och IV, möjliggjorde identifieringen av affinitetsmolekyler, Affibodies och Nanobodies, med olika kinetikprofiler och preferenser för olika konformationer och epitop hos målproteinerna. Studie III beskriver en djupgående karakterisering av två Nanobodies med avseende på deras egenskaper och hur de påverkade inhibering av proteaser, medan Studie IV utökade karakteriseringen till ytterligare Nanobody-familjer från samma selektions-process. 

I Studie II utvecklades en modulär plattform för selektiv genleverans till specifika celler och organ med hjälp av Adeno-associerade virus (AAVer). Genom att integrera Affibody-molekyler mot specifika cellreceptorer på virusytan var det möjligt att rikta leveransen av gener till celler som uttrycker målreceptorn. AAVerna levererade gener selektivt till celler som uttryckte målproteinet in vitro, och in vivo minskade leverupptaget samtidigt som genleveransen omdirigerades till andra organ. Även bindare framtagna i Studie I och IV utvärderades som målsökande ligander på AAV-ytan, vilket visade liknande resultat in vitro. Transduktionen berodde inte bara på att AAV kunde binda till målproteinet, utan även på faktorer såsom bindningsepitop, kinetikprofiler och integrationsplats på kapsiden. Detta belyser vikten av att bevara mångfald bland affinitetsproteinerna under utvecklingsprocessen, eftersom det är svårt att förutspå vilka egenskaper som är mest gynnsamma.

En ny ligand för rening av AAV9, som är baserad på ytterligare ett affinitetsprotein, Affimer, presenterades i Studie V. Under reningen presterade den lika bra som kommersiella reningsmatriser, men virusen kunde eluera vid mildare pH.

Slutligen gjordes en jämförelse mellan två sätt olika metoder att rena plasmiderna som behövs inom AAV-produktion, där Studie VI visar att val av renings-metod, buffert och produktionssystem påverkar produktionstitrarna.

Sammantaget bidrar arbetet i avhandlingen till utvecklingen av nya affinitetsproteiner med potential att användas inom framtida läkemedel och produktionsprocesser.

Link to DiVA