Investigations of chemical and enzymatic functionalization of affinity proteins
Tid: Fr 2020-09-11 kl 09.00
Plats: https://kth-se.zoom.us/webinar/register/WN_wkqf-V1QTmq4Czc22i7IMQ, Stockholm (English)
Ämnesområde: Bioteknologi
Respondent: Anders Myrhammar , Protein Engineering
Opponent: Professor, Doctor Christian Heinis, EPFL, Schweiz
Handledare: Professor Amelie Eriksson Karlström, Bioteknologi, Albanova VinnExcellence Center for Protein Technology, ProNova, Protein Engineering; Professor Per-Åke Nygren, Bioteknologi, Biokemi och biokemisk teknologi, Albanova VinnExcellence Center for Protein Technology, ProNova
Abstract
Affinitetsproteiner är viktiga reagenser inom forskning, diagnostik och i terapeutiska sammanhang. Fokus för denna avhandling har varit att undersöka olika kemiska och enzymatiska strategier för konstruktion av affinitetsproteiner för att generera affinitetsreagens med förbättrad eller förändrad funktionalitet. Modifieringarna som introducerades i affibody-molekyler (en typ av små, designade helix-proteiner) och i antikroppar valdes och implementerades med rationell design, genom en kombination av fastfas-peptidsyntes, gentekniska modifieringar och enzymatisk konjugering, beroende på situationen.
I en första studie introducerades intramolekylära tioeter-korslänkar mellan lysiner och cysteiner i den human epidermal growth factor receptor (hEGFR)-bindande affibodyn ZEGFR:1907, för att testa möjligheten att öka affibody-strukturens proteolytiska stabilitet. Tre olika varianter av korslänkad affibody framställdes med antingen en eller två korslänkar. Alla tre varianterna visade liknande affinitet till EFGR och hade samma sekundärstrukturinnehåll som det omodifierade kontrollproteinet. I ett stabilitetstest utsattes de korslänkade affibody-molekylerna för endopeptidaserna pepsin som finns i magen, samt trypsin och kymotrypsin som finns i tarmen. Alla tre affibody-molekylerna visade förbättrad stabilitet gentemot åtminstone ett av proteaserna, men den största förbättringen observerades hos den affibody-molekyl som innehöll två tvärbindningar, som hade bäst stabilitet i båda testerna.
Förbättring av proteolytisk stabilitet hos affibody-molekyler undersöktes ytterligare i en annan studie där sortas A-katalyserad intramolekylär ringslutningskonjugering av den dimeriska human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-bindande affibody-molekylen (ZHER2:342)2. Den cykliska dimeren uppvisade en liten ökning i smälttemperatur jämfört med den linjära dimeren samt oförändrad α-helicitet. Intressant nog visade den cykliska dimeren, i motsats till den linjära, inga tecken på proteolytisk nedbrytning efter 60 minuters exponering med exopeptidaset karboxypeptidas A.
Förmågan att ändra proteinfunktionalitet genom kemisk modifiering undersöktes i två studier. Den immunglobulinbindande Z-domänen, från vilken affibody-strukturen har utvecklats, användes som ett modellprotein i en studie där ljusinducerad affinitetsmodulering undersöktes. En azobensenswitch som isomeriserar från ett trans- till ett cis-tillstånd kopplades till en av helixarna i tre olika designer av Z-domänen. Den konformationella förändring som induceras genom isomerisering antogs vara tillräckligt stor för att orsaka en förlust i bindningsaffinitet för konjugerad affibody. Denna hypotes testades i en affinitetskromatografianalys, i vilken det visade sig att en av de modifierade affibody-molekylerna som bundit till en IgG-sepharose-kolonn tappade affinitet vid belysning.
Peptidnukleinsyra (PNA)-prober har tidigare framgångsrikt använts för selektiv hybridisering mellan tumörbindande primärt reagens och sekundärt reagens i ett pretargeting-system för in vivo avbildning av tumörer eller riktad terapi. I en sista studie fotokonjugerades ett Z-domän-PNAkonjugat producerat via sortas A-medierad konjugering till en laktosaminerad antikropp för möjlig användning som ett in vivo clearing agent (CA) för att avlägsna överskott av primärt reagens genom nedbrytning via levern. CA visade delvis framgång i en musmodell men konceptet behöver utvecklas vidare.
Arbetet i denna avhandling visar de olika möjligheter som finns tillgängliga för att ändra affinitetsproteiners funktionalitet genom kemiska och enzymatiska metoder för olika tillämpningar och ger ett ramverk för potentiell ytterligare förbättring av både affibody- och antikroppsfunktionalitet.