Imaging and reconstruction of membrane proteins with cryoEM

QC 2025-11-19

Abstract

Membranproteiner utgör 27% av det humana proteomet och spelar viktiga roller i cellulära processer. Dysfunktion hos membranproteiner orsakar och bidrar till olika sjukdomar. Studiet av membranproteiners struktur och funktion kommer att hjälpa oss att förstå dem på en djupare nivå. Kryoelektronmikroskopi (cryoEM) med singelpartikelanalys (SPA) kan inte bara ge oss högupplösta strukturer av membranproteiner utan även möjliggör studier av proteindynamik och de heterogena komplex de bildar. I denna avhandling tillämpade vi SPA tillsammans med elektrofysiologi, ytplasmonresonans (SPR) och mikroskalig termofores (MST) för att undersöka de strukturella och funktionella egenskaperna hos flera membranproteiner och proteinkomplex. 

I Artikel I studerade vi Pannexin 1 (PANX1), en kanal för ATP- frisättning som är inblandad i neurologiska sjukdomar och inflammation. Elektrofysiologi och masspektrometri identifierade aminosyran Y308 som en viktig fosforyleringsplats. CryoEM- strukturer avslöjade att fosforylerad PANX1 och PANX1 R75A- mutanter har konformell flexibilitet i transmembrandomänen. Våra data visar att PANX1 växlar mellan ett smalt och ett brett tillstånd. Denna övergång gör att N-terminalregionen antingen blir ordnad (bred) eller oordnad (smal). En fosformimetisk Y308E-mutant visar enbart en bred konformation med en ordnad N-terminus. Elektrofysiologi visar att denna mutation omvandlar PANX1 till en konstitutivt öppen kanal. Detta tyder på att Y308 är en fosforyleringsplats som låser PANX1 i den breda konformationen och möjliggör ATP-frisättning. 

Artikel II presenterar ett modifierat arbetsflöde för att identifiera och bestämma strukturerna av membranproteiner i ett heterogent prov, utan förkunskaper om proteinsekvensen eller en modell. Vi använde ett konventionellt SPA-arbetsflöde för att erhålla cryoEM-kartor. Dessa kartor modellerades oövervakat med ModelAngelo och en HMMER-sökning gjordes för att få sekvensinformation. Våra data gjorde det möjligt för oss att generera tre olika kartor från ett heterogent prov. Vi kunde identifiera varje protein enbart baserat på kartorna. Resultaten stöddes av masspektrometri. Bland de många proteiner som identifierades fanns de tre E. coli-membranproteinerna cytochrom bo3 oxidas (2.72 Å), AcrB (3.27 Å), och ett tidigare okarakteriserat E. coli ArnC-protein (2.72 Å). En annan viktig upptäckt i denna studie är att MSP2N2-nanodiskar anpassar sin sammansättning runt olika proteiner, vilket antyder att ställningsarkitekturen beror på proteininteraktioner. 

I Artikel III undersökte vi SMCT1-interaktioner med PDZK1. SMCT1 är ett viktigt membranprotein som transporterar monokarboxylat-substrat som butyrat, laktat eller niacin. PDZK1 har ansetts vara en viktig regulator som påverkar transporttakten hos SMCT1. Vi testade affiniteten för SMCT1 med olika assay. Våra pulldown-, SPR- och MST-assays tyder dock på att bindningen är mycket svag och sannolikt fysiologiskt irrelevant utom under förhållanden med lokal PDZK1-anrikning. 

Sammanfattningsvis demonstrerar detta arbete kraften i SPA för att lösa dynamiska membranproteiner, ge strukturella och funktionella insikter, och etablera arbetsflöden för att studera okända eller heterogena proteinkomplex. 

Translated by deepseek 

urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-373107